पीसीआर प्रतिक्रियांमध्ये हस्तक्षेप करणारे घटक

पीसीआर प्रतिक्रिया दरम्यान, काही हस्तक्षेप करणारे घटक अनेकदा येतात.
पीसीआरच्या अतिसंवेदनशीलतेमुळे, दूषित होणे हे पीसीआर परिणामांवर परिणाम करणारे सर्वात महत्वाचे घटक मानले जाते आणि चुकीचे सकारात्मक परिणाम देऊ शकतात.
खोटे-नकारात्मक परिणाम आणणारे विविध स्त्रोत तितकेच गंभीर आहेत. जर पीसीआर मिश्रणाचे एक किंवा अधिक आवश्यक भाग किंवा प्रवर्धन प्रतिक्रिया स्वतःच प्रतिबंधित किंवा व्यत्यय आणत असेल, तर निदान तपासणीला अडथळा येऊ शकतो. यामुळे कार्यक्षमता कमी होऊ शकते आणि चुकीचे नकारात्मक परिणाम देखील होऊ शकतात.
प्रतिबंधाव्यतिरिक्त, नमुना तयार करण्यापूर्वी शिपिंग आणि/किंवा स्टोरेज परिस्थितीमुळे लक्ष्य न्यूक्लिक ॲसिड अखंडतेचे नुकसान होऊ शकते. विशेषतः, उच्च तापमान किंवा अपर्याप्त संचयनामुळे पेशी आणि न्यूक्लिक ॲसिडचे नुकसान होऊ शकते. सेल आणि टिश्यू फिक्सेशन आणि पॅराफिन एम्बेडिंग ही डीएनए विखंडन आणि सततच्या समस्येची सुप्रसिद्ध कारणे आहेत (आकृती 1 आणि 2 पहा). या प्रकरणांमध्ये, इष्टतम अलगाव आणि शुद्धीकरण देखील मदत करणार नाही.

आकृती 1 | डीएनए अखंडतेवर स्थिरतेचा प्रभाव
Agarose जेल इलेक्ट्रोफोरेसीसने दर्शविले की शवविच्छेदनाच्या पॅराफिन विभागांपासून वेगळे केलेल्या DNA ची गुणवत्ता मोठ्या प्रमाणात बदलते. फिक्सेशन पद्धतीनुसार अर्कांमध्ये वेगवेगळ्या सरासरी तुकड्यांच्या लांबीचे डीएनए उपस्थित होते. मूळ गोठवलेल्या नमुन्यांमध्ये आणि बफर केलेल्या न्यूट्रल फॉर्मेलिनमध्ये निश्चित केल्यावरच डीएनए संरक्षित केला गेला. जोरदार अम्लीय बोइन फिक्सेटिव्ह किंवा अनबफर केलेले, फॉर्मिक ऍसिड-युक्त फॉर्मेलिन वापरल्याने डीएनएचे लक्षणीय नुकसान झाले. उर्वरित अपूर्णांक अत्यंत विखंडित आहे.
डावीकडे, तुकड्यांची लांबी किलोबेस जोड्यांमध्ये (kbp) व्यक्त केली जाते.

आकृती 2 | न्यूक्लिक ॲसिड लक्ष्यांच्या अखंडतेचे नुकसान
(a) दोन्ही स्ट्रँडवरील 3′-5′ अंतरामुळे लक्ष्यित DNA मध्ये खंड पडेल. डीएनएचे संश्लेषण अजूनही लहान तुकड्यावर होईल. तथापि, DNA तुकड्यावर प्राइमर ॲनिलिंग साइट गहाळ असल्यास, फक्त रेखीय प्रवर्धन होते. सर्वात अनुकूल स्थितीत, तुकडे एकमेकांना पुन्हा संतृप्त करू शकतात, परंतु उत्पन्न लहान आणि शोध पातळीपेक्षा कमी असेल.
(b) बेसचे नुकसान, मुख्यत्वे डिप्युरिनेशन आणि थायमिडीन डायमर फॉर्मेशनमुळे, एच-बॉन्ड्सची संख्या कमी होते आणि Tm कमी होते. वाढवलेल्या तापमानवाढीच्या अवस्थेत, प्राइमर्स मॅट्रिक्स डीएनएपासून दूर वितळतील आणि कमी कठोर परिस्थितीतही ते एनील होणार नाहीत.
(c) लगतच्या थायमिन बेस एक TT डायमर बनवतात.
आण्विक डायग्नोस्टिक्समध्ये सहसा उद्भवणारी आणखी एक सामान्य समस्या म्हणजे फिनॉल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षणाच्या तुलनेत लक्ष्य न्यूक्लिक ॲसिडचे कमी-इष्टतम प्रकाशन. अत्यंत प्रकरणांमध्ये, हे खोट्या नकारात्मकतेशी संबंधित असू शकते. सेल डेब्रिजचे उकळत्या लिसिस किंवा एन्झाईमॅटिक पचनाने बराच वेळ वाचवला जाऊ शकतो, परंतु या पद्धतीमुळे न्यूक्लिक ॲसिड अपुरे पडल्यामुळे पीसीआर संवेदनशीलता कमी होते.

प्रवर्धन दरम्यान पॉलिमरेझ क्रियाकलाप प्रतिबंध

सर्वसाधारणपणे, सबऑप्टिमल पीसीआर परिणामांना कारणीभूत असलेल्या सर्व घटकांचे वर्णन करण्यासाठी प्रतिबंध एक कंटेनर संकल्पना म्हणून वापरला जातो. काटेकोरपणे जैवरासायनिक अर्थाने, प्रतिबंध हे एन्झाइमच्या क्रियाकलापापुरते मर्यादित आहे, म्हणजे, ते डीएनए पॉलिमरेझ किंवा त्याच्या कोफॅक्टरच्या सक्रिय साइटशी संवाद साधून सब्सट्रेट-उत्पादनाचे रूपांतरण कमी करते किंवा प्रतिबंधित करते (उदा. Taq DNA पॉलिमरेझसाठी Mg2+).
नमुन्यातील घटक किंवा अभिकर्मक असलेले विविध बफर आणि अर्क हे एंझाइमला थेट रोखू शकतात किंवा त्याचे कोफॅक्टर्स (उदा. EDTA) अडकवू शकतात, ज्यामुळे पॉलिमरेझ निष्क्रिय होतात आणि परिणामी PCR परिणाम कमी होतात किंवा चुकीचे नकारात्मक होतात.
तथापि, प्रतिक्रिया घटक आणि लक्ष्य-युक्त न्यूक्लिक ॲसिड यांच्यातील अनेक परस्परसंवाद देखील 'PCR अवरोधक' म्हणून नियुक्त केले जातात. एकदा सेलची अखंडता अलगावने विस्कळीत झाली आणि न्यूक्लिक ॲसिड सोडले की, नमुना आणि त्याच्या सभोवतालचे द्रावण आणि घन अवस्था यांच्यातील परस्परसंवाद होऊ शकतो. उदाहरणार्थ, 'स्कॅव्हेंजर्स' नॉन-सहसंयोजक परस्परसंवादाद्वारे सिंगल- किंवा डबल-स्ट्रँडेड डीएनए बांधू शकतात आणि शेवटी PCR प्रतिक्रिया जहाजापर्यंत पोहोचणाऱ्या लक्ष्यांची संख्या कमी करून अलगाव आणि शुद्धीकरणात हस्तक्षेप करू शकतात.
सर्वसाधारणपणे, पीसीआर अवरोधक बहुतेक शरीरातील द्रव आणि अभिकर्मकांमध्ये असतात जे क्लिनिकल डायग्नोस्टिक चाचण्यांसाठी वापरले जातात (लघवीतील युरिया, हिमोग्लोबिन आणि रक्तातील हेपरिन), आहारातील पूरक पदार्थ (सेंद्रिय घटक, ग्लायकोजेन, चरबी, Ca2+ आयन) आणि वातावरणातील घटक (फिनॉल) , जड धातू)

अधिक प्रचलित पीसीआर अवरोधक जीवाणू आणि युकेरियोटिक पेशी, लक्ष्य नसलेल्या डीएनए, टिश्यू मॅट्रिक्सचे डीएनए-बाइंडिंग मॅक्रोमोलेक्यूल्स आणि हातमोजे आणि प्लास्टिकसारख्या प्रयोगशाळा उपकरणांमध्ये आढळू शकतात. PCR इनहिबिटर काढून टाकण्यासाठी न्युक्लिक ॲसिडचे शुध्दीकरण हे एक्सट्रॅक्शन दरम्यान किंवा नंतर पसंतीची पद्धत आहे.
आज, विविध स्वयंचलित निष्कर्षण उपकरणे अनेक मॅन्युअल प्रोटोकॉलची जागा घेऊ शकतात, परंतु 100% पुनर्प्राप्ती आणि/किंवा लक्ष्यांचे शुद्धीकरण कधीही साध्य झाले नाही. संभाव्य अवरोधक अद्याप शुद्ध केलेल्या न्यूक्लिक ॲसिडमध्ये उपस्थित असू शकतात किंवा आधीच प्रभावी होऊ शकतात. इनहिबिटरचा प्रभाव कमी करण्यासाठी विविध धोरणे अस्तित्वात आहेत. योग्य पॉलिमरेझची निवड इनहिबिटरच्या क्रियाकलापांवर महत्त्वपूर्ण परिणाम करू शकते. PCR प्रतिबंध कमी करण्यासाठी इतर सिद्ध पद्धती म्हणजे पॉलिमरेझ एकाग्रता वाढवणे किंवा BSA सारख्या ऍडिटीव्हज लागू करणे.
पीसीआर प्रतिक्रियांचे प्रतिबंध अंतर्गत प्रक्रिया गुणवत्ता नियंत्रण (IPC) वापरून प्रदर्शित केले जाऊ शकते.
इथेनॉल, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol आणि फिनॉल सारख्या एक्स्ट्रॅक्शन किटमधील सर्व अभिकर्मक आणि इतर सोल्यूशन्स, न्यूक्लिक ॲसिडपासून पूर्णपणे धुण्याच्या पायरीने वेगळे करण्यासाठी काळजी घेणे आवश्यक आहे. त्यांच्या एकाग्रतेवर अवलंबून, ते पीसीआर सक्रिय किंवा प्रतिबंधित करू शकतात.