पीसीआर प्रतिक्रियांमध्ये हस्तक्षेप घटक

पीसीआर प्रतिक्रियेदरम्यान, काही हस्तक्षेप करणारे घटक अनेकदा आढळतात.
पीसीआरच्या अतिसंवेदनशीलतेमुळे, दूषितता हा पीसीआर निकालांवर परिणाम करणारा सर्वात महत्वाचा घटक मानला जातो आणि त्यामुळे चुकीचे सकारात्मक परिणाम मिळू शकतात.
खोटे-नकारात्मक परिणाम देणारे विविध स्रोत देखील तितकेच महत्त्वाचे आहेत. जर पीसीआर मिश्रणाचे एक किंवा अधिक आवश्यक भाग किंवा प्रवर्धन अभिक्रिया स्वतःच रोखली गेली किंवा त्यात व्यत्यय आणला गेला तर निदान चाचणीमध्ये अडथळा येऊ शकतो. यामुळे कार्यक्षमता कमी होऊ शकते आणि खोटे नकारात्मक परिणाम देखील येऊ शकतात.
प्रतिबंधाव्यतिरिक्त, नमुना तयार करण्यापूर्वी शिपिंग आणि/किंवा साठवणुकीच्या परिस्थितीमुळे लक्ष्य न्यूक्लिक अॅसिडची अखंडता कमी होऊ शकते. विशेषतः, उच्च तापमान किंवा अपुरी साठवणुकीमुळे पेशी आणि न्यूक्लिक अॅसिडचे नुकसान होऊ शकते. पेशी आणि ऊतींचे स्थिरीकरण आणि पॅराफिन एम्बेडिंग ही डीएनए विखंडन आणि सततच्या समस्येची सुप्रसिद्ध कारणे आहेत (आकृती १ आणि २ पहा). या प्रकरणांमध्ये, इष्टतम अलगाव आणि शुद्धीकरण देखील मदत करणार नाही.

आकृती १ | डीएनए अखंडतेवर स्थिरीकरणाचा परिणाम
अ‍ॅगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिसने असे दर्शविले की शवविच्छेदनाच्या पॅराफिन विभागांपासून वेगळे केलेल्या डीएनएची गुणवत्ता बरीच वेगळी होती. फिक्सेशन पद्धतीनुसार अर्कमध्ये वेगवेगळ्या सरासरी तुकड्यांच्या लांबीचे डीएनए होते. मूळ गोठवलेल्या नमुन्यांमध्ये आणि बफर केलेल्या न्यूट्रल फॉर्मेलिनमध्ये निश्चित केल्यावरच डीएनए जतन केला गेला. जोरदार आम्लयुक्त बोइन फिक्सेटिव्ह किंवा बफर न केलेले, फॉर्मिक अ‍ॅसिड-युक्त फॉर्मेलिन वापरल्याने डीएनएचे लक्षणीय नुकसान झाले. उर्वरित अंश अत्यंत विखंडित आहे.
डावीकडे, तुकड्यांची लांबी किलोबेस जोड्यांमध्ये (kbp) व्यक्त केली आहे.

आकृती २ | न्यूक्लिक अॅसिड लक्ष्यांच्या अखंडतेचे नुकसान
(अ) दोन्ही स्ट्रँडवरील 3′-5′ अंतरामुळे लक्ष्य डीएनएमध्ये खंड पडेल. डीएनएचे संश्लेषण अजूनही लहान तुकड्यावर होईल. तथापि, जर डीएनए तुकड्यावर प्राइमर अॅनिलिंग साइट गहाळ असेल, तर फक्त रेषीय प्रवर्धन होते. सर्वात अनुकूल परिस्थितीत, तुकडे एकमेकांना पुनर्संतृप्त करू शकतात, परंतु उत्पादन लहान आणि शोध पातळीपेक्षा कमी असेल.
(b) बेसचे नुकसान, प्रामुख्याने डिप्युरिनेशन आणि थायमिडीन डायमर निर्मितीमुळे, H-बंधांची संख्या कमी होते आणि Tm मध्ये घट होते. वाढवलेल्या तापमानवाढीच्या टप्प्यात, प्राइमर्स मॅट्रिक्स डीएनएपासून वितळतील आणि कमी कठोर परिस्थितीतही ते वितळणार नाहीत.
(c) लगतच्या थायमिन बेसमुळे TT डायमर तयार होतो.
आण्विक निदानात वारंवार उद्भवणारी आणखी एक सामान्य समस्या म्हणजे फिनॉल-क्लोरोफॉर्म एक्सट्रॅक्शनच्या तुलनेत लक्ष्य न्यूक्लिक अॅसिडचे कमी प्रमाणात प्रकाशन. अत्यंत प्रकरणांमध्ये, हे खोट्या निगेटिव्हशी संबंधित असू शकते. उकळत्या लिसिस किंवा पेशींच्या ढिगाऱ्याचे एंजाइमॅटिक पचन करून बराच वेळ वाचवता येतो, परंतु या पद्धतीमुळे अनेकदा न्यूक्लिक अॅसिडच्या अपुर्‍या प्रकाशनामुळे पीसीआर संवेदनशीलता कमी होते.

प्रवर्धनादरम्यान पॉलिमरेज क्रियाकलाप प्रतिबंधित करणे

सर्वसाधारणपणे, सबऑप्टिमल पीसीआर निकालांकडे नेणाऱ्या सर्व घटकांचे वर्णन करण्यासाठी इनहिबिशनचा वापर कंटेनर संकल्पना म्हणून केला जातो. पूर्णपणे जैवरासायनिक अर्थाने, इनहिबिशन एंजाइमच्या क्रियाकलापांपुरते मर्यादित आहे, म्हणजेच, ते डीएनए पॉलिमरेझच्या सक्रिय साइट किंवा त्याच्या सहघटकाशी (उदा., टॅक डीएनए पॉलिमरेझसाठी Mg2+) परस्परसंवादाद्वारे सब्सट्रेट-उत्पादन रूपांतरण कमी करते किंवा प्रतिबंधित करते.
नमुन्यातील घटक किंवा अभिकर्मक असलेले विविध बफर आणि अर्क थेट एंजाइमला रोखू शकतात किंवा त्याचे सहघटक (उदा. EDTA) अडकवू शकतात, ज्यामुळे पॉलिमरेझ निष्क्रिय होते आणि परिणामी कमी किंवा खोटे नकारात्मक PCR परिणाम मिळतात.
तथापि, प्रतिक्रिया घटक आणि लक्ष्य-युक्त न्यूक्लिक अॅसिडमधील अनेक परस्परसंवादांना 'पीसीआर इनहिबिटर' म्हणून देखील नियुक्त केले जाते. एकदा पेशीची अखंडता अलगावमुळे विस्कळीत झाली आणि न्यूक्लिक अॅसिड सोडले गेले की, नमुना आणि त्याच्या सभोवतालच्या द्रावण आणि घन टप्प्यातील परस्परसंवाद होऊ शकतात. उदाहरणार्थ, 'स्कॅव्हेंजर्स' नॉन-कोव्हॅलेंट परस्परसंवादाद्वारे एकल- किंवा दुहेरी-अडकलेल्या डीएनएला बांधू शकतात आणि अखेर पीसीआर प्रतिक्रिया वाहिनीपर्यंत पोहोचणाऱ्या लक्ष्यांची संख्या कमी करून अलगाव आणि शुद्धीकरणात व्यत्यय आणू शकतात.
सर्वसाधारणपणे, पीसीआर इनहिबिटर बहुतेक शरीरातील द्रवपदार्थांमध्ये आणि क्लिनिकल डायग्नोस्टिक चाचण्यांसाठी वापरल्या जाणाऱ्या अभिकर्मकांमध्ये (मूत्रात युरिया, रक्तात हिमोग्लोबिन आणि हेपरिन), आहारातील पूरक (सेंद्रिय घटक, ग्लायकोजेन, चरबी, Ca2+ आयन) आणि वातावरणातील घटकांमध्ये (फिनॉल, जड धातू) असतात.

अधिक प्रचलित पीसीआर इनहिबिटर हे बॅक्टेरिया आणि युकेरियोटिक पेशी, लक्ष्य नसलेले डीएनए, टिश्यू मॅट्रिक्सचे डीएनए-बाइंडिंग मॅक्रोमोलेक्यूल्स आणि ग्लोव्हज आणि प्लास्टिक सारख्या प्रयोगशाळेतील उपकरणांमध्ये आढळू शकतात. पीसीआर इनहिबिटर काढून टाकण्यासाठी एक्सट्रॅक्शन दरम्यान किंवा नंतर न्यूक्लिक अॅसिडचे शुद्धीकरण ही पसंतीची पद्धत आहे.
आज, विविध स्वयंचलित निष्कर्षण उपकरणे अनेक मॅन्युअल प्रोटोकॉलची जागा घेऊ शकतात, परंतु लक्ष्यांची १००% पुनर्प्राप्ती आणि/किंवा शुद्धीकरण कधीही साध्य झालेले नाही. संभाव्य अवरोधक अजूनही शुद्ध केलेल्या न्यूक्लिक अॅसिडमध्ये उपस्थित असू शकतात किंवा आधीच प्रभावी झाले असतील. अवरोधकांचा प्रभाव कमी करण्यासाठी वेगवेगळ्या रणनीती अस्तित्वात आहेत. योग्य पॉलिमरेझची निवड अवरोधक क्रियाकलापांवर महत्त्वपूर्ण परिणाम करू शकते. पीसीआर अवरोध कमी करण्यासाठी इतर सिद्ध पद्धती म्हणजे पॉलिमरेझ एकाग्रता वाढवणे किंवा बीएसए सारखे अॅडिटीव्ह वापरणे.
अंतर्गत प्रक्रिया गुणवत्ता नियंत्रण (IPC) वापरून PCR प्रतिक्रियांचे प्रतिबंधन दाखवता येते.
न्यूक्लिक अॅसिड आयसोलेटमधून इथेनॉल, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, आयसोप्रोपॅनॉल आणि फिनॉल सारखे सर्व अभिकर्मक आणि इतर द्रावण पूर्णपणे धुवून काढून टाकण्याची काळजी घेतली पाहिजे. त्यांच्या एकाग्रतेवर अवलंबून, ते PCR सक्रिय किंवा प्रतिबंधित करू शकतात.