पीसीआर प्रतिक्रियांमधील हस्तक्षेप घटक

पीसीआर प्रतिक्रियेदरम्यान, काही हस्तक्षेप करणारे घटक बर्‍याचदा सामोरे जातात.
पीसीआरच्या अत्यंत उच्च संवेदनशीलतेमुळे, पीसीआरच्या परिणामावर परिणाम करणारे सर्वात महत्त्वाचे घटक म्हणून दूषित होणे आणि खोटे सकारात्मक परिणाम देऊ शकते.
तितकेच गंभीर असे विविध स्त्रोत आहेत ज्यामुळे खोटे-नकारात्मक परिणाम होतो. जर पीसीआर मिश्रणाचे एक किंवा अधिक आवश्यक भाग किंवा प्रवर्धन प्रतिक्रिया स्वतःच प्रतिबंधित केली गेली किंवा हस्तक्षेप केली तर डायग्नोस्टिक परखमध्ये अडथळा आणला जाऊ शकतो. यामुळे कार्यक्षमता कमी होऊ शकते आणि चुकीचे नकारात्मक परिणाम देखील होऊ शकतात.
प्रतिबंध व्यतिरिक्त, नमुना तयार होण्यापूर्वी शिपिंग आणि/किंवा साठवण परिस्थितीमुळे लक्ष्य न्यूक्लिक acid सिडची अखंडता कमी होऊ शकते. विशेषतः, उच्च तापमान किंवा अपुरा साठवण यामुळे पेशी आणि न्यूक्लिक ids सिडचे नुकसान होऊ शकते. सेल आणि टिश्यू फिक्सेशन आणि पॅराफिन एम्बेडिंग ही डीएनए फ्रॅगमेंटेशन आणि सतत समस्या (आकडेवारी 1 आणि 2 पहा) ची सुप्रसिद्ध कारणे आहेत. या प्रकरणांमध्ये, इष्टतम अलगाव आणि शुद्धीकरण देखील मदत करणार नाही.

आकृती 1 | डीएनए अखंडतेवर स्थिरतेचा प्रभाव
अ‍ॅगरोस जेल इलेक्ट्रोफोरेसीसने हे सिद्ध केले की डीएनएची गुणवत्ता शवविच्छेदनाच्या पॅराफिन विभागांमधून वेगळी केली जाते. फिक्सेशन पद्धतीनुसार अर्कांमध्ये भिन्न सरासरी तुकड्यांच्या लांबीचे डीएनए उपस्थित होते. मूळ गोठलेल्या नमुन्यांमध्ये आणि बफरर्ड तटस्थ फॉर्मेलिनमध्ये निश्चित केल्यावरच डीएनए जतन केले गेले. जोरदार acid सिडिक बोइन फिक्सेटिव्ह किंवा अनब्यफर्ड, फॉर्मिक acid सिडयुक्त फॉर्मलिनच्या वापरामुळे डीएनएचे महत्त्वपूर्ण नुकसान झाले. उर्वरित अंश अत्यंत खंडित आहे.
डावीकडे, तुकड्यांची लांबी किलोबेस जोड्यांमध्ये व्यक्त केली जाते (केबीपी)

आकृती 2 | न्यूक्लिक acid सिड लक्ष्यांची अखंडता कमी होणे
(अ) दोन्ही स्ट्रँडवरील 3′-5 ′ अंतरामुळे लक्ष्य डीएनएमध्ये ब्रेक होईल. डीएनएचे संश्लेषण अद्याप लहान तुकड्यावर होईल. तथापि, डीएनए तुकड्यावर प्राइमर ne नीलिंग साइट गहाळ असल्यास, केवळ रेषीय प्रवर्धन होते. सर्वात अनुकूल प्रकरणात, तुकडे एकमेकांना पुनर्वसन करू शकतात, परंतु उत्पादन लहान आणि शोधण्याच्या पातळीपेक्षा कमी असेल.
(बी) तळांचे नुकसान, मुख्यत: डिप्रिनेशन आणि थायमिडीन डायमर निर्मितीमुळे, एच-बॉन्ड्सची संख्या कमी होते आणि टीएममध्ये घट होते. वाढवलेल्या तापमानवाढ टप्प्यात, प्राइमर मॅट्रिक्स डीएनएपासून दूर वितळतील आणि कमी कठोर परिस्थितीतही अ‍ॅनेल करणार नाहीत.
(सी) जवळील थायमाइन तळ टीटी डायमर बनवतात.
आण्विक निदानामध्ये बर्‍याचदा उद्भवणारी आणखी एक सामान्य समस्या म्हणजे फिनोल-क्लोरोफॉर्म एक्सट्रॅक्शनच्या तुलनेत लक्ष्य न्यूक्लिक ids सिडस्चे कमी-इष्टतम रिलीज. अत्यंत प्रकरणांमध्ये, हे खोट्या नकारात्मकतेशी संबंधित असू शकते. उकळत्या लिसिस किंवा सेल मोडतोडच्या एंझाइमॅटिक पचनामुळे बराच वेळ वाचविला जाऊ शकतो, परंतु या पद्धतीमुळे बहुतेक वेळा न्यूक्लिक acid सिडच्या अपुरेपणामुळे पीसीआर संवेदनशीलता कमी होते.

प्रवर्धन दरम्यान पॉलिमरेज क्रियाकलाप प्रतिबंधित

सर्वसाधारणपणे, सबोप्टिमल पीसीआर परिणामास कारणीभूत ठरणार्‍या सर्व घटकांचे वर्णन करण्यासाठी कंटेनर संकल्पना म्हणून प्रतिबंध केला जातो. काटेकोरपणे जैवरासायनिक अर्थाने, प्रतिबंधक एंजाइमच्या क्रियाकलापांपुरते मर्यादित आहे, म्हणजेच ते डीएनए पॉलिमरेज किंवा त्याच्या कोफेक्टर (ईजी, एमजी 2+) च्या सक्रिय साइटसह परस्परसंवादाद्वारे सब्सट्रेट-उत्पादन रूपांतरण कमी करते किंवा प्रतिबंधित करते.
नमुना मधील घटक किंवा अभिकर्मक असलेले विविध बफर आणि अर्क थेट सजीवांच्या शरीरात निर्मार्ण होणारे द्रव्य रोखू शकतात किंवा त्याच्या कोफेक्टर (उदा. ईडीटीए) ला ट्रॅप करू शकतात, ज्यामुळे पॉलिमरेज निष्क्रिय होते आणि यामुळे पीसीआर परिणाम कमी होतात.
तथापि, प्रतिक्रिया घटक आणि लक्ष्य-युक्त न्यूक्लिक ids सिडस् दरम्यानचे बरेच संवाद देखील 'पीसीआर इनहिबिटर' म्हणून नियुक्त केले जातात. एकदा सेलची अखंडता अलगावमुळे विस्कळीत झाली आणि न्यूक्लिक acid सिड सोडल्यानंतर, नमुना आणि त्याच्या आसपासच्या सोल्यूशन आणि घन टप्प्यात परस्परसंवाद होऊ शकतात. उदाहरणार्थ, 'स्कॅव्हेंजर्स' नॉन-कोव्हॅलेंट परस्परसंवादांद्वारे एकल- किंवा डबल-स्ट्रेंडेड डीएनए बांधू शकतात आणि अखेरीस पीसीआर प्रतिक्रिया पात्रात पोहोचणार्‍या लक्ष्यांची संख्या कमी करून अलगाव आणि शुद्धीकरणात हस्तक्षेप करू शकतात.
सर्वसाधारणपणे, पीसीआर इनहिबिटर क्लिनिकल डायग्नोस्टिक चाचण्यांसाठी (मूत्र, हिमोग्लोबिन आणि रक्तातील यूरिया), आहारातील पूरक आहार (सेंद्रिय घटक, ग्लाइकोजेन, फॅट, सीए 2+ आयन) आणि वातावरणातील घटक (फिनोल्स, हेवी मेटल्स) मध्ये वापरल्या जाणार्‍या बहुतेक शरीरातील द्रव आणि अभिकर्मकांमध्ये उपस्थित असतात.

अधिक प्रचलित पीसीआर इनहिबिटर बॅक्टेरिया आणि युकेरियोटिक पेशी, नॉन-टार्गेट डीएनए, डीएनए-बाइंडिंग मॅक्रोमोलिक्यूल्स ऑफ टिश्यू मॅट्रिक आणि ग्लोव्हज आणि प्लास्टिक सारख्या प्रयोगशाळेच्या उपकरणांमध्ये आढळू शकतात. एक्सट्रॅक्शन दरम्यान किंवा नंतर न्यूक्लिक ids सिडची शुद्धीकरण ही पीसीआर इनहिबिटर काढून टाकण्यासाठी प्राधान्य दिलेली पद्धत आहे.
आज, विविध स्वयंचलित माहिती उपकरणे बर्‍याच मॅन्युअल प्रोटोकॉलची जागा घेऊ शकतात, परंतु 100% पुनर्प्राप्ती आणि/किंवा लक्ष्यांचे शुद्धीकरण कधीही प्राप्त झाले नाही. संभाव्य अवरोधक अद्याप शुद्ध न्यूक्लिक ids सिडमध्ये असू शकतात किंवा आधीच प्रभावी होऊ शकतात. इनहिबिटरचा प्रभाव कमी करण्यासाठी भिन्न रणनीती अस्तित्वात आहेत. योग्य पॉलिमरेजच्या निवडीचा इनहिबिटर क्रियाकलापांवर महत्त्वपूर्ण परिणाम होऊ शकतो. पीसीआर प्रतिबंध कमी करण्यासाठी इतर सिद्ध पद्धती पॉलिमरेज एकाग्रता वाढवित आहेत किंवा बीएसए सारख्या itive डिटिव्ह्ज लागू करत आहेत.
अंतर्गत प्रक्रिया गुणवत्ता नियंत्रण (आयपीसी) च्या वापराद्वारे पीसीआर प्रतिक्रियांचे प्रतिबंध दर्शविले जाऊ शकते.
इथेनॉल, ईडीटीए, सीटाब, एलआयसीएल, गस्कन, एसडीएस, आयसोप्रोपॅनॉल आणि फिनोल सारख्या एक्सट्रॅक्शन किटमधील सर्व अभिकर्मक आणि इतर उपाय काढून टाकण्यासाठी काळजी घेणे आवश्यक आहे. त्यांच्या एकाग्रतेवर अवलंबून, ते पीसीआर सक्रिय किंवा प्रतिबंधित करू शकतात.